В 1520 году при игумене Дорофее и его советнике – старце Филарете, обитель вновь – после долгих лет бедствия расцвела. В это время была расширена Успенская церковь, в ней был устроен придел преп. Антония и Феодосия Киево-Печерских, был построен деревянный храм во имя Св. Сорока Севастийских мучеников, тогда же было начато сооружение монастырской звонницы. Всеми этими работами в монастыре руководил представитель великого князя во Пскове «государев дьяк» Мисюрь Мунехин.

Важные изменения в Печерской обители произошли при Корнилии, ставшем в 1529 году игуменом монастыря. В игуменство Корнилия были возведены мощные крепостные стены (длина около 700 метров) и башни, Благовещенский храм, церковь святителя Николая, Большая монастырская звонница. Игумен Корнилий был редактором Псковской III летописи. При игумене Корнилии монастырь приобрел роль культурного центра Псковской земли: здесь была собрана богатейшая библиотека, благодаря чему до нашего времени сохранился один из замечательных памятников древнерусской литературы «Слово о погибели земли Русской». Из библиотеки Псково-Печерского монастыря происходят и «Печерские сборники», донесшие до нас выдающийся исторический и литературный памятник – переписку князя Андрея Курбского с царем Иваном Грозным. При игумене Корнилии началась постоянная миссионерская деятельность монастыря в приграничных районах южной Эстонии.

Монастырские летописи сообщают, что в 1584 году в монастыре было 100 монахов и около 300 послушников.

Крепость Псково-Печерского монастыря сыграла значительную роль в обороне Псковских рубежей во время нашествия Стефана Батория.

После осады войсками Батория монастырь неоднократно подвергался нападениям. В 1592 году шведы ворвались неожиданно в Псково-Печерский монастырь, разграбили все монастырское имущество, побили братию, разорили и сожгли церкви и кельи.

В память о чудесном спасении Пскова и Печерского монастыря в 1581 году, позднее, в начале 17 века был установлен крестный ход в Седьмую неделю по Пасхе из Псково-Печерского монастыря в Псков с образом Успения Богородицы в житии (впервые крестный ход прошел в 1602 году).